La trama se centra en la búsqueda que Mario y Luigi deben emprender para salvar a la «Dinosaur Land» y rescatar a la Princesa Toadstool de las garras de Bowser, el antagonista principal de la serie. Ambos hermanos deben viajar por siete mundos para restaurar el orden en «Dinosaur Land».4 Para el juego, se basó en el gameplay de anteriores entregas de la saga, y además fueron introducidos nuevos poderes que aumentan las habilidades de los personajes, junto con otros aspectos que sirvieron como base para varios títulos posteriores de la serie. El pequeño dinosaurio verde, Yoshi, es introducido por primera vez en toda la historia de la serie; a su vez éste le permite a Mario montar sobre él, y con ello avanzar más rápido a través de «Dinosaur Land».5 Miyamoto comentó que desde la producción de Super Mario Bros., deseaba incluir un dinosaurio para que fuese el compañero de Mario durante su aventura.6 En ésta entrega, fueron incluidos nuevos power-ups que le permiten al jugador percibir nuevas opciones de gameplay; de entre los nuevos ítems que figuran en ésta entrega, destaca la «Cape Feather», la cual le permite al protagonista adquirir una capa con la cual puede volar por un cierto tiempo en el aire, algo parecido a lo ya visto en Super Mario Bros. 3